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Darmflora

Für Ärzte und Therapeuten

Mikrobiom, Mikrobiota und Metagenom

Dr. rer. nat. Isabell Flade - Center for Metagenomics, Tübingen (CeMeT GmbH)

Seit dem Aufkommen der Next-Generation-Sequencing-Geräte vor etwa zehn Jahren hat auch die Analyse des menschlichen Darmmikrobioms beträchtlichen Aufwind bekommen. Dr. Isabell Flade, Geschäftsführerin der CeMeT GmbH in Tübingen veranschaulichte, was die Wissenschaft derzeit im Bereich Mikrobiom-Forschung leisten kann.

Wer bis vor etwa 10 Jahren die Zusammensetzung eines Bakteriengemischs untersuchen wollte, stellte sich einem recht langwierigen und schwierigen Unterfangen. Denn lange Zeit wurden Bakterien zur Identifizierung auf Selektivmedien kultiviert. Das Prinzip: Bestimmte Bakterien konnten nur auf bestimmten Nährböden wachsen. Auch mit Hilfe der Massenspektrometrie oder einer biochemischen Selektion („bunte Reihe“) ließ sich die Bakterienart identifizieren. Doch die Untersuchungen dauerten oft lange, die Anzuchtmöglichkeiten auf Selektivmedien waren eingeschränkt und die Massenspektrometrie konnte nur bei Bakterien angewendet werden, die sich auch im Labor kultivieren ließen.

Anaerobier aus dem Darm schwierig anzuzüchten

Vor allem die Analyse des Darmmikrobioms mit seinen unzähligen unterschiedlichen Bakterien war mit den Methoden schwierig. Der Grund: „Im menschlichen Darm gibt es relativ wenig Sauerstoff, weshalb hier bevorzugt Anaerobier wachsen. Diese sind jedoch unter Laborbedingungen nur sehr schwer zu kultivieren“, erklärte Dr. Isabell Flade, Geschäftsführerin der CeMeT GmbH in Tübingen. Neben alternativen molekularbiologische Methoden wie der Polymerasekettenreaktion (PCR) und der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kamen vor etwa zehn Jahren auch neue Next-Generation-Sequenzierungsmethoden auf den Markt.

Verschiedene Next-Generation-Sequenzierungsmethoden

Bei einer DNA-Sequenzierung können Wissenschaftler heute zwischen verschiedenen methodischen Ansätzen wählen. „Ziel einer solchen DNA-Sequenzierung eines Bakteriengemischs ist es, über eine kurze DNA-Sequenz Rückschlüsse auf die Identität und die Funktionen der Bakterien zu ziehen“, erklärte Flade das prinzipielle Vorgehen. Bis vor etwa zehn Jahren stand dazu ausschließlich die Sequenzierung nach Sanger zur Verfügung. Das kleine Probenformat und die anschließende Gel-Elektrophorese lassen die Sanger Sequenzierung heutzutage umständlich wirken. Der größte Schwachpunkt ist jedoch: „Die Sequenzen aus Probengemischen lassen sich hier nicht voneinander trennen. Für die Analyse des Darmmikrobioms eignet sich die Sanger-Sequenzierung also nicht“, so Flade.

Auswertung nur mit Bioinformatik möglich

Die Next-Generation-Sequencing-Geräte hingegen können sehr viele Sequenzen gleichzeitig und in Echtzeit analysieren. Dazu isolieren Wissenschaftler zunächst die DNA aus den Proben und erstellen Sequenzierbibliotheken. Auf die eigentliche Sequenzierung folgt die Datenauswertung. „Nach einer Sanger-Sequenzierung erhalten Sie eine einzige DNA-Sequenz. Mit einem Next-Generation-Sequencing-Gerät kommen Sie bei einem kleinen Ansatz bereits auf circa 20 Millionen Sequenzen“, veranschaulichte Flade, und weiter: „Da wird schnell klar, dass wir zur Auswertung auf bioinformatische Methoden angewiesen sind.“

DNA-Isolierung standardisieren und Fehlerquellen ausschalten

Allerdings ist Vorsicht geboten: Obwohl die vorbereitenden Schritte überschaubar sind, können bereits kleine Veränderungen in der Handhabung die Ergebnisse beeinflussen. Die Art und Weise der DNA-Isolierung aus den Bakterienzellen ist ein Beispiel dafür. Denn die zahlreichen Bakterien im Darm unterscheiden sich teils beträchtlich in ihrem Aufbau. Während einige Arten leichter aufzuspalten sind, gelingt das bei anderen nur mit großem, teilweise auch mechanischem Einsatz. „Bei der DNA-Isolierung sollte man darauf achten, nicht nur an die leicht zu isolierende DNA zu gelangen“, erklärte Flade. Bei einer aggressiven DNA-Isolation hingegen kann bereits freigewordene DNA aus leicht aufzulösenden Bakterien verloren gehen. „Um die Ergebnisse vergleichbar zu machen, sollte man auch bei der DNA-Isolierung auf einen gesunden Mittelweg achten“, so Flade weiter.

Im nächsten Schritt - der eigentlichen Sequenzanalyse - unterscheiden sich je nach Methode die Readlänge, die Genauigkeit der Reads und die Anzahl der Reads pro Probe. „Je länger ein Read ist, desto exakter lässt er sich einem Organismus zuordnen. Und nur wenn ich eine große Anzahl von Reads betrachte, erfasse ich auch die seltenen Sequenzen in einer Probe“, fasst Flade die Tücken bei der Sequenzanalyse zusammen.

Sequenzanalyse der DNA

1977 - etwa 25 Jahre nach Entschlüsselung der DNA-Struktur - entwickelte Fred Sanger eine Methode zur Sequenzanalyse der DNA, bei der enzymatisch neue DNA erzeugt und anschließend analysiert wird.

Nach der Jahrtausendwende eroberten neue Sequenziermethoden den Markt. Die Sequenziermethoden der nächsten Generation („Next generation sequencing“) bieten die Möglichkeit der kostengünstigen und schnellen Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierung eines kompletten Genoms.

Die meisten der Ultra-Hochdurchsatz-Methoden verwenden nicht mehr eine Auftrennung der DNA über Kapillarelektrophorese wie die klassische Sanger-Methode, sondern sie koppeln Moleküle an Oberflächen und nehmen Reihen von hochauflösenden Bildern auf. Dabei entstehen gigantische Datenmengen, die nur mit Hilfe der Bioinformatik ausgewertet werden können.

Was sind Reads?

Reads sind DNA-Sequenzabschnitte, die die Sequenziermaschinen auslesen (englisch: to read = lesen). Ein ganzes Genom von Anfang bis Ende durchzulesen, ist heute technisch noch nicht möglich. Mit zunehmender Read-Länge wird das Signal schwächer und damit unzuverlässiger. Erst durch die Überlappung mehrerer Reads mit bioinformatischen Methoden entsteht am Ende eine komplette DNA-Sequenz.

Identifizierung von Bakterien: Welche Methode passt zu welcher Fragestellung?

Welche Bakterienarten? 16S-Analysen   
Welche Bakterienarten und was tun sie? Shotgun-Metagenomics
Was tun die Bakterien? Meta-Transcriptomics

Je nach Fragestellung stehen im Moment unterschiedliche Analysemethoden zur Verfügung. „Interessiere ich mich nur dafür, welche Bakterien sich in einer Probe befinden, kommt die 16S-Analyse zum Zug“, so Flade. Die Analyse basiert auf dem 16SrRNA-Gen, das in allen Bakterien vorkommt. Das 16S-Gen besteht aus konservierten und variablen Bereichen. „Die konservierte Sequenz ist in allen bekannten Bakterien identisch“, so Flade. Die variablen Bereiche unterscheiden sich von Bakterienart zu Bakterienart.

„Möchte ich hingegen wissen, welche Bakterien sich in einer Probe befinden und was diese Bakterien tun, greife ich zu den Shotgun-Metagenomics“, so Flade weiter. Mit den Meta-Transcriptomics hingegen lässt sich klären, was Bakterien in einer Probe verstoffwechseln.

Bakterien identifizieren: die 16S-Analyse

Über eine PCR mit Primern für die konservierten Bereiche lassen sich die 16S-Gene aller Bakterien vervielfältigen – samt der stark variierenden variablen Bereich. „Über diese Bereiche lassen sich dann die Bakterien identifizieren“, erklärt Flade. Wie häufig ein Bakterium in einer Probe vorkommt, lässt sich mit der Methode allerdings nicht eindeutig klären. „Das liegt daran, dass Bakterien verschieden viele Kopien der 16S-rRNA haben und die Kopienanzahl nicht für alle Bakterien bekannt ist“. Da die 16S-Methode nur einen sehr kleinen Teil des bakteriellen Genoms erfasst, lassen sich mit dem Ansatz keine Aussagen über die Stoffwechselgeschehnisse in der Bakterienprobe treffen. Der große Vorteil des Ansatzes sind jedoch die geringen Analysekosten. „Wegen der geringen Kosten wird diese Methode aktuell in der Forschung am häufigsten verwendet“, berichtete Flade.

Der umfassende Überblick: die Shotgun Metagenomics

Bei den Shotgun Metagenomics wird die gesamte DNA einer mikrobiellen Probe untersucht. Sie liefert Informationen über die Bakterienarten und deren Stoffwechselleistungen. Auch andere Mikroorganismen wie Viren und Pilze werden darüber erkannt. „Hier zieht man über die vorhandenen Gene Rückschlüsse, welche Stoffwechselprozesse im Bakteriengemisch ablaufen könnten“, so Flade. Auch Vielfalt und Diversität der Mikroben lassen sich mit der Methode abschätzen.

Meta-Transcriptomics

Die Meta-Transcriptomics erfassen ausschließlich aktive Gene, denn bei der Methode werden nur die mRNA-Moleküle erfasst. Da die bakterielle rRNA in der Regel vorher angereichert wird, liefert die Methode keine Informationen zu den Bakterienarten.

Warum sind die Informationen über die mikrobielle Besiedlung des Darms so wichtig?  

Darmbakterien stehen in ständigem Austausch mit ihrem Wirt – dem Menschen. Grundsätzlich erfüllen die Bakterien im Darm viele nützliche Aufgaben: Sie spalten Nährstoffe aus der Nahrung, stellen Vitamine her, unterstützen und schulen das Immunsystem und verhindern die Ansiedlung von Krankheitserregern. Stimmt die Zusammensetzung der Darmflora nicht oder nicht mehr, spricht man heute von einer „Dysbiose“. „Diese muss nicht zwangsläufig eine Fehlbesiedlung bedeuten. Manchmal nehmen auch grundsätzlich nützliche Bakterien im Laufe ihres Lebens fremde Gene auf, deren Produkte dem Menschen schaden können“, erklärte Flade.

Darmflora beeinflusst Therapien

Heute weiß man: Bei zahlreichen Erkrankungen ist das Darm-Mikrobiom aus dem Gleichgewicht geraten. Bekannt ist das Phänomen heute bei Adipositas1, Darmkrebs2, Diabetes3, Depressionen4 und vielen weiteren Erkrankungen.

Die Darm-Mikroben können auch Therapien beeinflussen. „Es gibt Therapien, die nur dann erfolgreich sind, wenn bestimmte Mikroorganismen im Darm sind. Dazu gehören zum Beispiel bestimmte Immuntherapien bei Krebs“, erklärte Flade. Im Gegenzug könnten Darmbakterien jedoch auch bestimmte Medikamente inaktivieren, bevor sie ihre Wirkung entfalten konnten.5 Flade dazu: „Stuhltransplantationen bieten eine Möglichkeit für neue therapeutische Ansätze. Im Moment verstehen wir die Mechanismen dahinter noch nicht vollständig, aber ich vermute, dass sich dieser Ansatz in Zukunft durchsetzen wird.“

Das Henne-Ei-Problem

Seit dem Aufkommen der neuen Sequenziermöglichkeiten untersuchen immer mehr Studien den Zusammenhang zwischen Mikrobiom und vor allem chronischen Erkrankungen untersuchen, allerdings beschäftigt sich die große Mehrheit der Studien lediglich mit Assoziationen. Dabei beobachten Wissenschaftler, welche Krankheitsbilder bei welcher bakteriellen Zusammensetzung vorkommen. Die Mechanismen hinter den Assoziationen sind meist noch unbekannt. „Genauso stehen wir heute noch häufig vor der Henne-Ei-Frage“, veranschaulichte Flade. Denn solange die molekularen Mechanismen hinter den Assoziationen nicht geklärt sind, lasse sich nicht sagen, ob bestimmte Erkrankungen das Darm-Mikrobiom verändern oder ob vielleicht das umgekehrte Phänomen der Fall sei.

Rein in die Klinik mit dem „Tübiom“

Genau diesem Problem nimmt sich nun das Tübinger Sequenzierungsunternehmen CeMeT – Center for Metagenomics – unter der Geschäftsführung von Flade und Dr. Dirk Biskup an. „Unser Ziel ist er, den Transfer von der Forschung hinein in die Klinik, in den Alltag der Ärzte, voranzutreiben“, so Flade. Die zentralen Fragen des Projekts lauten: Was ist ein normales Mikrobiom? Und können wir das Darm-Mikrobiom durch unseren Lebensstil gezielt so beeinflussen, dass es sich positiv auf unsere Gesundheit auswirkt?

Das Ziel des „Tübiom-Projektes“ ist es, die Zusammenhänge zwischen der Zusammensetzung des Darm-Mikrobioms und unserer Gesundheit besser zu verstehen. Dazu wollen die Wissenschaftler um Flade Stuhlproben von 10.000 Freiwilligen analysieren und mit den Angaben aus einem Gesundheitsfragebogen korrelieren. Im März 2017 hatte Flades Team bereits 3.000 Stuhlproben erhalten.

Personalisierte Darmflora-Medizin

Langfristig haben sich die Tübinger Wissenschaftler zum Ziel gesetzt, das menschliche Mikrobiom mit Hilfe der Metagenomik genau zu vermessen und Normalwerte zu definieren. Gelingt der Ansatz, lassen sich mit Hilfe der Daten weitere Biomarker und Risikofaktoren für bestimmte Erkrankungen definieren. Das Darm-Mikrobiom bietet dann einen geeigneten Ansatz für die Diagnostik und Intervention bei diesen Erkrankungen. Anti-, Pre- und Probiotika könnten eine ungünstige Zusammensetzung der Mikrobiota gezielt beeinflussen. Bestimmte Medikamente würden nur noch dann verschrieben, wenn das Mikrobiom des Patienten eine erfolgreiche Therapie verspricht.

Literatur:

  1. Paun A., Yau C. and Danska J.S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. J Immunol. 2017 Jan 15;198(2):590-595.
    doi: 10.4049/jimmunol.1601519
  2. Sanmiguel C., Gupta A., and Mayer E.A. Gut Microbiome and Obesity: A Plausible Explanation for Obesity. Curr Obes Rep. 2015 Jun;4(2):250-61.
    doi: 10.1007/s13679-015-0152-0.
  3. Gagnière, J. et al. Gut microbiota imbalance and colorectal cancer. World J Gastroenterol. 2016 Jan 14;22(2):501-18.
    doi: 10.3748/wjg.v22.i2.501.
  4. Foster, J.A. and McVey Neufeld K.A. Gut-brain axis: how the microbiome influences anxiety and depression. Trends Neurosci. 2013 May;36(5):305-12.
    doi: 10.1016/j.tins.2013.01.005.
  5. Vétizou, M. et al. Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota. Science. 2015 Nov 27;350(6264):1079-84.
    doi: 10.1126/science.aad1329.

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